多重PCR (Multiplex polymerase chain reaction，MPCR) 是指通過一次 PCR 反應(yīng)同時(shí)對多個(gè)靶標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)合一定的檢測手段對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，從而實(shí)現(xiàn)對多個(gè)靶目標(biāo)進(jìn)行診斷的技術(shù)。MPCR 具有高效率、高通量、低成本的特性而被深入研究。
目前 MPCR 技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究和疾病診斷等領(lǐng)域，文中從 MPCR 擴(kuò)增與檢測兩方面概述了 MPCR 技術(shù)發(fā)展及其應(yīng)用，討論了 MPCR 技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)及存在的問題，并且提出將反應(yīng)體系分隔成小液滴或結(jié)合管式對流 PCR (Capillary convective PCR，CCPCR) 技術(shù)的方式有望提高固相載體表面的擴(kuò)增效率，從而開發(fā)出擴(kuò)增效率高、一致性好、體系穩(wěn)定、檢測重?cái)?shù)高的多重 PCR 技術(shù)。
一、多重PCR技術(shù)原理
多重PCR技術(shù)是在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入多個(gè)引物對，同時(shí)擴(kuò)增同一DNA或不同DNA的多個(gè)靶序列。這些靶序列的長度不同，使得擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳分析時(shí)能夠被有效區(qū)分。多重PCR技術(shù)由Chamberlain等于1988年建立，其原理與常規(guī)PCR相同，但需要優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，使其適合各個(gè)引物對及其靶序列。
二、多重?zé)晒舛?PCR 技術(shù)
多重?zé)晒舛?PCR (Multiple fluorescencequantitative PCR)技術(shù)是在熒光定量 PCR 技術(shù)的基礎(chǔ)上，利用幾種不同熒光基團(tuán)的組合，結(jié)合儀器對不同通道熒光的檢測能力實(shí)現(xiàn)對多個(gè)靶標(biāo)的實(shí)時(shí)定量檢測。
TaqMan水解探針 (Hydrolysisprobes) 是多重?zé)晒?PCR 體系中常用也是最多一種探針，探針一端標(biāo)記發(fā)光基團(tuán)，另一端標(biāo)記淬滅基團(tuán)，通過在不同序列末端標(biāo)記不同熒光基團(tuán)及相應(yīng)的淬滅基團(tuán)，即可形成不同的 TaqMan 水解探針，將上述探針及相應(yīng)的擴(kuò)增引物加至同一反應(yīng)體系，即可實(shí)現(xiàn)對多個(gè)靶標(biāo)的共同檢測。
三、基于熒光染料的多重 PCR 技術(shù)
非特異性的熒光染料嵌入到 DNA 雙鏈小溝中后，在特定的激發(fā)光激發(fā)后將會產(chǎn)生一定波長的熒光。
以此為基礎(chǔ)發(fā)展了熔解曲線 (Meltingcurve) 分析法，利用不同 DNA 序列具有不同 Tm 值的特征，在 PCR 反應(yīng)結(jié)束后，通過程序升溫使雙鏈逐漸解鏈成單鏈，當(dāng)達(dá)到雙鏈特異的 Tm 值所對應(yīng)的溫度時(shí)，熒光強(qiáng)度大幅度降低，利用這樣的原理可以對 PCR 中不同長度的雙鏈產(chǎn)物或相同長度不同 GC 含量的雙鏈進(jìn)行分析。
利用多重實(shí)時(shí)PCR 熔解曲線分析的方法，進(jìn)行病毒鑒別。
針對不同的型別設(shè)計(jì)了特異性的引物對，從而對模板進(jìn)行擴(kuò)增生成不同的擴(kuò)增子，擴(kuò)增子之間T m 值各有差異，最后通過熔解曲線峰的位置進(jìn)行鑒別。
在熔解曲線分析技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的高分辨率熔解曲線技術(shù)是一種利用飽和染料，借助高分辨率的儀器，實(shí)現(xiàn)對單個(gè)核苷酸熔解溫度不同從而形成不同形態(tài)熔解曲線，進(jìn)而對基因進(jìn)行分析的新技術(shù)，它具有極高的靈敏度，能夠檢測出單個(gè)堿基之間的差別，目前主要應(yīng)用于單核苷酸多態(tài)性分析、甲基化分析、基因突變、基因分型等領(lǐng)域檢測 。
四、多重PCR技術(shù)的應(yīng)用
多重PCR技術(shù)在基因研究、臨床診斷、法醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值，以下列舉了一些典型應(yīng)用實(shí)例：
01模板定量
多重PCR技術(shù)可以在同一反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)靶序列，從而實(shí)現(xiàn)對模板DNA的定量分析。
02基因多態(tài)性分析
多重PCR技術(shù)可用于分析微衛(wèi)星DNA和單核苷酸多態(tài)性（SNP），為研究個(gè)體間的遺傳差異提供有效手段。
03連鎖分析
多重PCR技術(shù)可以在同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增多個(gè)基因片段，從而實(shí)現(xiàn)對這些基因的連鎖分析。
04基因突變分析
多重PCR技術(shù)可用于分析基因突變，如Duchenne型肌營養(yǎng)不良等疾病。
05病原體鑒定與分型
多重PCR技術(shù)可在同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增多個(gè)病原體的特異性基因，從而實(shí)現(xiàn)病原體的快速鑒定與分型。
06法醫(yī)學(xué)鑒定
多重PCR技術(shù)在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用，如親子鑒定、犯罪現(xiàn)場分析等。
07食品分析
多重PCR技術(shù)可用于檢測食品中的病原體、違禁添加劑等。
