QPCR閾值線怎么調整？

自動設置：大多數Real-time qPCR儀器會自動設置熒光閾值。通常，這個閾值是基線的標準偏差的10倍。

手動設置：用戶可以手動調整閾值線，通常將其放置在擴增曲線的對數期，即熒光信號明顯增強的階段。手動設置需要一定的經驗和技巧，通常在指數擴增期的中期或后期。

閾值設定的原則和目的：閾值的設定應高于基線，但足夠低，以便控制在擴增曲線的對數期。這樣設置的目的是確保擴增效率接近2倍，同時避免擴增進入平臺期或線性期，從而保證數據的準確性。

閾值設定對實驗結果的影響：閾值的設定直接影響?Ct值。如果閾值設置得太高，可能會導致數據不準確，進入平臺期或線性期后，擴增效率和其它誤差帶來的數據偏差會增加。因此，合理的閾值設定對于保證實驗結果的準確性和可重復性至關重要。

閾值：我們在操作軟件時上下拉動的橫線，是決定Ct值的因素之一。閾值是熒光信號相對于基線有顯著增強的點，大多數儀器會根據基線平均信號，自動計算熒光信號的閾值水平，并設置一個比平均值高10倍的閾值。也就是說，當基線被正確的設置了，閾值也能手動調整成正確值。典型的擴增曲線可以分成四個時期：基線期，指數期，線性期，平臺期。?????????

閾值線的概念：閾值線(threshold)，相交于擴增曲線的一條水平線，用于確定熒光信號的閾值（Cycle Threshold，Ct）。此線可決定樣本的Ct值，所以十分重要！！！熒光閾值線的設定一般在 PCR 擴增的指數期，為PCR反應前3-15個循環的熒光信號標準差的10倍。

閾值線的調整原則：

一、閾值線應位于擴增曲線的指數增長期中或后部，因為這一區域是樣本重復性最好的部分，能夠準確反映PCR擴增的起始點；

二、閾值線要高于陰性對照和基線噪音；

三、最佳的閾值線位置應該是在擴增曲線接近線性和線與線之間相互平行的位置；

四、多重qPCR實驗中，每個靶標或通道都要單獨設置合適的閾值線（不同靶標擴增的信號大小和指數期的位置會有差異）；

五、閾值線設置過高，Ct值偏大，超過擴增曲線的線性期或平臺期，那么得到的數據將不準確；

六、閾值線設置過低，Ct值偏小，且有可能受到噪音信號的干擾。